細胞凋亡檢測方法在腫瘤研究中的應(yīng)用
細胞凋亡的細胞化學測定

細胞凋亡的細胞化學測定包括細胞表面（細胞膜）的結(jié)構(gòu)和通透性改變的測定和細胞核DNA改變的測定。根據(jù)應(yīng)用的范圍，又可分為細胞群休和單個細胞測定兩種，以下僅介紹其中幾種較為常用的方法。

碘化丙啶（propidium iodide,PI）檢測

早期死亡細胞膜通透性狀態(tài)的不同是區(qū)分細胞凋亡和壞死的一個重要指標，凋亡細胞在進入zui終溶解階段前，胞膜通透性無明顯改變，相對分子質(zhì)量大的與DNA結(jié)合的熒光染料（如PI）不能時入凋亡細胞內(nèi)，而相對分子質(zhì)量小的熒光染料（如Hoechest 3342或33258等）仍能被細胞攝取。應(yīng)用流式細胞儀或熒光顯微鏡可區(qū)分和壞死細胞，細胞內(nèi)DNA出現(xiàn)Hoechest 3342標記而不出現(xiàn)PI標記的為凋亡細胞。

細胞凋亡檢測方法在腫瘤研究中的應(yīng)用
檢測方法：獲取11×106細胞/ml的細胞懸液，先用PI染色，再行Hoechest3342染色，進行流式細胞儀分析或熒光顯微鏡觀察。PI及Hoechest3342均使用340nm紫外線激發(fā)，前者熒光為紅色（620nm）,后者熒光為藍色（480nm）。正常細胞藍色zui強。早期凋亡細胞由于DNA的漏出藍色稍弱并有少量的紅色熒光，晚期凋亡細胞紅色熒光加強。壞死細胞紅色熒光zui強。

膜聯(lián)蛋白（annexin）V標記

正常細胞的細胞膜磷脂分布是不對稱的，磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine,PS）位于細胞膜內(nèi)側(cè)，在細胞凋亡時轉(zhuǎn)至細胞膜外表面，這一改變被認為是特導性的，并且可作為凋亡細胞表面改變的標記。PS表面化發(fā)生于凋早期，其機制尚不清，可能是一種導致機體吞噬凋亡細胞的信號。膜聯(lián)蛋白V是Ca2+依賴的磷脂結(jié)合蛋白，對PS具有高度親和力，熒光標記的膜聯(lián)蛋白V與細胞表現(xiàn)PS結(jié)合，再用顯微鏡或流式細胞儀進行檢測，可以觀察凋亡過程中細胞膜PS的表面化。結(jié)合PI染色進行雙參數(shù)檢測尚能區(qū)分正常細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞及壞死細胞。正常細胞膜聯(lián)蛋白V（-）PI（-），早期凋亡細胞膜聯(lián)蛋白V（+）PI（-），晚期凋亡細胞和壞死細胞膜聯(lián)蛋白V（+）PI（+）。有研究表明膜聯(lián)蛋白V標記僅有不到三分之一的凋亡細胞出現(xiàn)陽性標記，其原因尚不明。同時需注意度的是凋亡后期溶解階段，細胞碎片也可出現(xiàn)明顯的陽性著色。

檢測方法：1×106細胞/ml細胞懸液，先后用膜聯(lián)蛋白V--FITC及PI染色，流式細胞儀分析，獲得由四個象限組成的細胞直方圖（cytogram），每個象限的細胞數(shù)目就是在檢測細胞總數(shù)在所點的組份。左下象限代表正常細胞（An-PI-）,右下象限代表早期凋亡細胞（An+PI-），右上象限代表晚期凋亡細胞和壞死細胞（An+PI+）,左上象限代表細胞收集過程中出現(xiàn)的損傷細胞（An-PI+）。用生物素標記膜聯(lián)蛋白V還可以作體內(nèi)試驗。將生物素標記膜聯(lián)蛋白V注射小鼠體內(nèi)，30分鐘后處死，迅速取出要研究的組織置于甲醛內(nèi)固定，然后，常規(guī)石蠟切片，脫蠟、水化，用親和素標記的過氧化物酶程程序孵育，DAB顯色，光鏡下觀察凋亡細胞。

DNA瓊脂凝膠電泳法

細胞凋亡時，在內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的作用下，DNA在核小體間被切割成180-200bp整數(shù)倍的單或寡核苷酸片段，在電泳時表現(xiàn)為特征性的“梯形帶”。自Wyllie把內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶降解產(chǎn)生“梯形帶”與細胞凋亡相以來，“梯形帶”被作為細胞凋亡的一個重要的生化指標。盡管有報道指出，實驗中出現(xiàn)典型的形態(tài)改變時可不伴有核小體間的DNA降解，對這一指標提出質(zhì)疑，本方法仍被廣泛應(yīng)用。但此方法敏感性不高，大量凋亡細胞同時存在時才出現(xiàn)典型的結(jié)果，且只能被用于細胞群體，不能用于組織的原位檢測。

檢測方法：培養(yǎng)細胞清洗、離心，加入細胞裂解液裂解，高速離心，取上清液用酚/氯仿抽提二次，RNA酶消化，然后加到含溴已錠的1％-2％的瓊脂糖凝膠的樣品的孔中進行電泳，zui后在紫外線燈下觀察和攝影。

DNA裂解的原位檢測

在細胞水平檢測DNA裂解的原位標記技術(shù)已越來越多地被用于組織切片和培養(yǎng)細胞，細胞凋亡時，由于DNA的裂解，形成單或寡核小體的雙鏈相對分子質(zhì)量小的片段及在相對分子質(zhì)量大的DNA上形成單的繼裂（缺口，nick）。此類斷裂可用生物素、地高辛或熒光素標記的核苷酸在3`-OH端予以顯示。通常采用的酶是DNA聚合酶I或未端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT），前者使核苷酸結(jié)合于缺口，需要模板存在，標記方法通常被稱為“原位缺口平移”（insitu nick translation,ISNT）,后者使核苷酸在雙鏈的斷端延伸，不需要模板的存在，其方法被稱為未端記（end labeling）、加尾法（tailing reaction）或TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）。上述方法，尤其是TUNEL的應(yīng)用已很廣泛，其優(yōu)點是可用于原位標記，可用于病理組織，并可進行定量分析。值得注意的是壞死期由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶和蛋白質(zhì)酶的何等用，DNA被切割成大小不等的片段，也可出現(xiàn) 陽性反應(yīng)。組織或細胞外理不當時可出現(xiàn)假陽性。因而，TUNEL等方法對凋亡細胞的標記是選擇性的。而不是特異性的，TUNEL或其他DNA裂解原位標記的分析應(yīng)結(jié)合陽性細胞的形態(tài)，尤其是核的特征，細胞的分布和有無炎癥反應(yīng)，除外非凋亡的陽性反應(yīng)。

檢測方法：石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，蛋白質(zhì)酶K消化，TdT酶和核苷酸混合液孵育，顯色（辣根過氧化物酶標記可用DAB顯色，堿性磷酸酶標可用NBT+BCIP顯色），復染，脫水，封片。凋亡細胞核呈現(xiàn)藍色（NBT+BCIP顯色）或者棕黃色（DAB顯色）。

凋亡蛋白質(zhì)酶（Caspase）-3及其底物的檢測

凋亡蛋白質(zhì)酶是一類半胱氨酸蛋白質(zhì)酶，具有特異性水解底物分子天冬氨酸（Asp）殘七C端肽鍵功能，是近年隨著調(diào)亡研究的深入而發(fā)現(xiàn)的重要凋亡分子。迄今已有13個分子得到命名，分別為凋亡蛋白質(zhì)酶1-13。基中凋亡蛋白質(zhì)-3是被認為在多種組織、細胞類型中zui常涉及的凋亡效應(yīng)分子?；罨牡蛲龅鞍踪|(zhì)酶-3僅在凋亡細胞中發(fā)現(xiàn)，因此，檢測凋亡蛋白質(zhì)酶-3的活性有助于發(fā)現(xiàn)早期的凋亡細胞。一般采用人工合成四肽熒光底物如DEVD-AMC，凋亡蛋白質(zhì)酶-3在D與AMC之間水解，釋放熒光物質(zhì)、AMC，后者在紫外線激發(fā)下發(fā)出波長為430-460nm的熒光，通過流式細胞儀或分光光度計對其強度進行定量，從而測定凋亡蛋白質(zhì)酶-3的活性。由于醛對凋亡蛋白質(zhì)酶-3的水解活性抑制作用，因此同時加入含醛四肽如DEVD-CHO可以抑制凋亡蛋白質(zhì)酶-3對DEVD-AMC的水解，不產(chǎn)生熒光。這樣的抑制試驗可作為對照，使凋亡蛋白質(zhì)酶-3的活性分析更有特異性。但是，上述方法不適用于組只切片，因此有人嘗試采用針對活化的凋亡蛋白質(zhì)酶-3亞基的抗體，通過免疫組化顯示凋亡細胞，然而其敏感性及特異性尚不能令人滿意。

檢測方法：培養(yǎng)細胞（也可以預先作凋亡誘導并在不同時段收集細胞）在裂解液內(nèi)裂解、離心、去上清液。加入凋亡蛋白質(zhì)酶-3的底物（如DEVD-AMC）孵育，同時用不加底物的樣品作對照，流式細胞儀檢測，加有底物的樣品釋放出的熒光強度樣對照樣品明顯增強。如加入DEVD-AMC時再加入DEVD-CHO，樣品釋放的熒光強度與對照樣品無差異。

細胞凋亡檢測方法在腫瘤研究中的應(yīng)用
凋亡蛋白質(zhì)酶-3導致細胞凋良心是通過水解或滅活一些細胞關(guān)鍵蛋白質(zhì)實現(xiàn)的，因此檢測凋亡蛋白質(zhì)酶-3底物的改變也有助于辨認細胞的凋亡。PARP是*個被認識的凋亡蛋白質(zhì)酶-3底物，它的相對分子質(zhì)量為116000，水解后形成相對分子質(zhì)量為85000及相對分子質(zhì)量為25000的兩個片段，用運載相對分子質(zhì)量為85000片段的抗體可以觀察細胞是否發(fā)生凋亡。細胞骨架蛋白中的CK-18被凋亡蛋白質(zhì)酶-3水解后，在其C端的第387-396位氨基酸殘基形成一個新的抗原表位，用抗此表位的抗體可以在組織切片上辨認凋亡細胞。另外一種細胞骨架蛋白質(zhì)肌動蛋白（actin）被水解后產(chǎn)生一種稱為“fractin”的片段，在凋亡早期出現(xiàn)，并認為與細胞膜的起泡有關(guān)，可能有助于早期凋亡細胞的辨認。總之，隨著對凋亡蛋白質(zhì)酶及其底物的進一步研究，將會發(fā)現(xiàn)更有價值的有助于檢測凋亡細胞的方法。