人β-防御素2試劑盒實驗原理說明書

使用目的：
本人β-防御素試劑盒用于測定人血清、血漿及相關(guān)液體樣本中β-防御素2（HβD-2）含量。

實驗原理
本人β-防御素試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中人β-防御素2（HβD-2）水平。用純化的人β-防御素2（HβD-2）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入β-防御素2（HβD-2），再與HRP標記的β-防御素2（HβD-2）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的β-防御素2（HβD-2）呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中人β-防御素2（HβD-2）濃度。 

試劑盒組成 
1 30倍濃縮洗滌液 20ml×1瓶 7 終止液 6ml×1瓶
2 酶標試劑 6ml×1瓶 8 標準品（320pg/ml） 0.5ml×1瓶
3 酶標包被板 12孔×8條 9 標準品稀釋液 1.5ml×1瓶
4 樣品稀釋液 6ml×1瓶 10 說明書 1份
5 顯色劑A液 6ml×1瓶 11 封板膜 2張 
6 顯色劑B液 6ml×1/瓶 12 密封袋 1個

標本要求 
1．人β-防御素標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融
2．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟
標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。
160pg/ml 5號標準品 150μl的原倍標準品加入150μl標準品稀釋液
80pg/ml 4號標準品 150μl的5號標準品加入150μl標準品稀釋液
40pg/ml 3號標準品 150μl的4號標準品加入150μl標準品稀釋液
20pg/ml 2號標準品 150μl的3號標準品加入150μl標準品稀釋液
10pg/ml 1號標準品 150μl的2號標準品加入150μl標準品稀釋液

加樣：人β-防御素分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。 
配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用
洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。 
溫育：操作同3。
洗滌：操作同5。
顯色：人β-防御素每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.
終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。